MATERI KESEHATAN
MATERI
POKOK:
Konsep dan teknis Imunohistokimia
1. Definisi
2. anti gen
3. antibodi
4. ikatan antigen dan antibodi
5. teknis imunohistokimia
1.
Definisi Imunohistokimia
Imunohistokimia
merupakan suatu cara pemeriksaan untuk mengukur derajat imunitas atau kadar
antibodi atau antigen dalam sediaan jaringan. Nama imunohistokimia diambil dari
nama immune yang menunjukkan bahwa prinsip dasar dalam proses ini ialah
penggunaan antibodi dan histo menunjukkan jaringan secara mikroskopis. Dengan
kata lain, imunohistokimia adalah metode untuk mendeteksi keberadaan antigen
spesifik di dalam sel suatu jaringan dengan menggunakan prinsip pengikatan
antara antibodi (Ab) dan antigen (Ag) pada jaringan hidup. Pemeriksaan ini
membutuhkan jaringan dengan jumlah dan ketebalan yang bervariasi tergantung
dari tujuan pemeriksaan.
2. Antigen
Antigen adalah bahan yang dapat
merangsang respon imun dan dapat bereaksi dengan antibodi. Macam-macam antigen
antara lain imunogen adalah bahan yang dapat merangsang respon imun dan
hapten adalah bahan yang dapat bereaksi dengan antibodi. Antigen tersusun atas
epitop dan paratop. Epitop atau Determinan adalah bagian dari antigen yang
dapat mengenal/ menginduksi pembenntukan antibodi, sedangkan paratop adalah
bagian dari antibodi yang dapat mengikat epitop.
1. Jenis antigen berdasarkan determinannya:
a.Unideterminan, univalen, merupakan jenis epitop
satu dan jumlahnya satu
b.Unideterminan, multivalen, merupakan jenis
epitop satu, jumlah lebih dari satu
c.Multideterminan, univalen, merupakan jenis
epitop lebih dari satu dan jumlahnya satu
d.Multideterminan, multivalen, merupakan jenis
epitop lebih dari satu, jumlah lebih dari satu
2.Jenis antigen berdasarkan spesifiktasnya
a.Heteroantigen → dimiliki banyak spesies
b.Xenoantigen → dimiliki spesies tertentu
c.Alloantigen → dimiliki satu spesies
d.Antigen organ spesifik → dimiliki organ
tertentu
e.Autoantigen → berasal dari tubuhnya sendiri
3.Jenis antigen berdasarkan ketergantungan pada
sel T:
a. T dependen adalah tentang antigen yang
perlu pengenalan thd sel T dan sel B untuk merangsang antibodi
b. T Independen adalah tentang antigen yang dapat
merangsang sel B tanpa mengenal sel T dahulu
4. Jenis antigen berdasarkan kandungan bahan
kimianya:
a. Karbohidrat merupakan imunogenik
b. Lipid: tidak imunogenik merupakan hapten
c .Asam nukleat merupakan antigen yang tidak
imunogenik
d. Protein merupakan imunogenik
3. Antibodi
Antigen adalah bahan yang dapat
merangsang respon imun dan dapat bereaksi dengan antibodi. Macam-macam antigen
antara lain imunogen adalah bahan yang dapat merangsang respon imun dan
hapten adalah bahan yang dapat bereaksi dengan antibodi. Antigen tersusun atas
epitop dan paratop. Epitop atau Determinan adalah bagian dari antigen yang
dapat mengenal/ menginduksi pembenntukan antibodi, sedangkan paratop adalah
bagian dari antibodi yang dapat mengikat epitop.
1. Jenis antigen berdasarkan determinannya:
a.Unideterminan, univalen, merupakan jenis epitop
satu dan jumlahnya satu
b.Unideterminan, multivalen, merupakan jenis
epitop satu, jumlah lebih dari satu
c.Multideterminan, univalen, merupakan jenis
epitop lebih dari satu dan jumlahnya satu
d.Multideterminan, multivalen, merupakan jenis
epitop lebih dari satu, jumlah lebih dari satu
2.Jeni antigen berdasarkan spesifiktasnya
a. Heteroantigen → dimiliki banyak spesies
b. Xenoantigen → dimiliki spesies tertentu
c. Alloantigen → dimiliki satu spesies
d. Antigen organ spesifik → dimiliki organ
tertentu
e. Autoantigen → berasal dari tubuhnya sendiri
3.Jenis antigen berdasarkan ketergantungan pada
sel T:
a.T dependen adalah tentang antigen yang
perlu pengenalan thd sel T dan sel B untuk merangsang antibodi
b.T Independen adalah tentang antigen yang dapat
merangsang sel B tanpa mengenal sel T dahulu
4. Jenis antigen berdasarkan kandungan bahan
kimianya:
a. Karbohidrat merupakan imunogenik
b. Lipid: tidak imunogenik merupakan hapten
c. Asam nukleat merupakan antigen yang tidak
imunogenik
d. Protein merupakan imunogenik
Contoh-contoh antigen antara lain:
1. Bakteri
2. Virus
3. Sel darah yang
asing
4. Sel-sel dari
transplantasi organ
5. Toksin
Sifat-sifat umum imunogen
1. Keasingan
Kebutuhan utama dan pertama suatu molekul untuk memenuhi syarat
sebagai imunogen adalah bahwa zat tersebut secara genetik asing terhadap
hospes. Secara alami respon imun akan terjadi pada komponen yang biasanya tidak
ada dalam tubuh atau biasanya tidak terpapar pada sistem limforetikuler hospes.
2. Sifat-sifat Fisik
Agar suatu zat dapat menjadi imunogen, ia harus mempunyai ukuran
minimum tertentu, imunogen yang mempunyai berat molekul yang kecil, respon
terhadap hospes minimal, dan fungsi zat tersebut sebagai hapten sesudah
bergabung dengan proten-proten jaringan. Hapten dapat merangsang terjadinya respon
imun yang kuat jika bergabung proten pembawa dengan ukuran sesuai.Perlu
diperhatikan bahwa hapten-proten diarahkan pada (1)hapten,(2)pembawa, dan
(3)daerah spesifikasi tumpang tindih. yang melibatkan hapten dan unsur yang
berdekatan lainnya. Pada imunitas humoral, spesifisitas diarahkan pada
hapten.sedangkan pada imunitas selular, reaktifitas diarahkan baik pada hapten
maupun pada proten pembawa.
3. Kompleksitas.
Faktor-faktor yang mempengaruhi kompleksitas imunogen meliputi
baik sifat fisik maupun kimia molekul. Keadaan aggegasi molekul misalnya dapat
mempengaruhi imunogenitas. Larutan proten-protein monometrik dapat benar-benar
merangsang terjadinya keadaan refraktair atau tolerans bila berada dalam bentuk
monometrik, tetapim sangat imunogen bila dalam berada polimetrik atau keadaan
agregasi.
4. Bentuk-bentuk (Conformation)
Tidak adanya bentuk dari molekul tertentu yang imunogen.
Polipeptid linear atau bercabang, karbohidrat linear atau bercabang, serta
protein globular, semuanya mampu merangsang terjadinya respon imun.Meskipun
demikian antibodi yang dibentuk dari aneka macam kombinasi struktur adalah
sangat spesifik dan dapat dengan cepat mengenal perbedaan-perbedaan ini. Bila
bentuk antigen berubah, antibodi dirangsang dalam bentuk aslinya yang tidak
bergabung lagi
5. Muatan (charge)
Imunogenitas tidak terbatas pada molekuler tertentu;tidak
terbatas pada molekuler tertentu, zat-zat yang bermuatan positif, negatif, dan
netral dapat imunogen. Namun demikian imunogen tanpa muatan akan memunculkan
antibodi yang tanpa kekuatan . Telah terbukti bahwa imunitas dengan beberapa
imunogen bermuatan positif akan menghasilkan imunogen bermuatan negatif.
6. Kemampuan masuk
Kemampuan masuk suatu kelompok determinan pada sistem pengenalan
akan menentukan hasil respon imun. Perkembangan baru-baru ini telah
memungkinkan penelitian untuk mempersiapkan polipeptid imunogenik sintetik yang
berisi sejumlah asam amino terbatas dan yang susunan kimianya dapat ditentukan.
3. Antibodi
Antibodi
adalah protein serum yang mempunyai respon imun (kekebalan) pada tubuh yang
mengandung Imunoglobulin (Ig). Ig dibentuk oleh sel plasma (proliferasi sel B)
akibat kontak/dirangsang oleh antigen. Macam Imunoglobulin: Ig G, Ig A, Ig M,
Ig E dan Ig D.a.Imunoglobulin G
Terbanyak dalam serum (75%).
Dapat menembus plasenta membentuk imunitas bayi sampai berumur 6 sampai dengan
9 bulan. Mempunyai sifat opsonin berhubungan erat dengan fagosit, monosit
dan makrofag. Berperan pada imunitas seluler yang dapat merusak antigen seluler
berinteraksi dengan komplemen, sel K, eosinofil dan neutrofil.
b.Imunoglobulin
A
Sedikit dalam serum.
Banyak terdapat dalam saluran nafas, cerna, kemih, air mata, keringat,
ludah dan air susu. Fungsinya menetralkan toksin dan virus, mencegah kontak
antara toksin/ virus dng sel sasaran dan mengumpalkan/ mengganggu gerak kuman
yang memudahkan fagositosis.
c.Imunoglobulin
M
Tidak dapat menembus plasenta,
dibentuk pertama kali oleh tubuh akibat rangsangan antigen sifilis,
rubela, toksoplasmosis. Fungsinya mencegah gerakan mikroorganisme antigen
memudahkan fagositosis dan Aglutinosis kuat terhadap antigen.
d.Imunoglobulin
E
Jumlah paling sedikit dalam
serum. Mudah diikat oleh sel mastosit, basofil dan eosinofil. Kadar tinggi pada
kasus: alergi, infeksi cacing, skistosomiasis, trikinosis. Proteksi terhadap
invasi parasit seperti cacing.
e.Imunoglobulin
D
Sedikit ditemukan dalam
sirkulasi. Tidak dapat mengikat komplemen. Mempunyai aktifitas antibodi
terhadap makanan dan autoantigen.
Antibodi
merupakan senjata yang tersusun dari protein dan dibentuk untuk melawan sel-sel
asing yang masuk ke tubuh manusia. Senjata ini diproduksi oleh sel-sel B,
sekelompok prajurit pejuang dalam sistem kekebalan.
Antibodi
akan menghancurkan bakteri atau virus tertentu yang menyerang sistem pertahanan
tubuh manusia. Antibodi mempunyai dua fungsi, pertama untuk mengikatkan diri
kepada sel-sel musuh, yaitu antigen. Fungsi kedua adalah membusukkan struktur
biologi antigen tersebut lalu menghancurkannya. Berada dalam aliran darah dan
cairan non-seluler, antibodi mengikatkan diri kepada bakteri dan virus penyebab
penyakit. Mereka menandai molekul-molekul asing tempat mereka mengikatkan diri.
Dengan demikian sel prajurit tubuh dapat membedakan sekaligus
melumpuhkannya.Antibodi bersesuaian dengan antigen secara sempurna, seperti
anak kunci dengan lubangnya yang dipasang dalam struktur tiga dimensi. Tubuh
manusia mampu memproduksi masing-masing antibodi yang cocok untuk hampir setiap
musuh yang dihadapinya. Antibodi bukan berjenis tunggal. Sesuai dengan struktur
setiap musuh, maka tubuh menciptakan antibodi khusus yang cukup kuat untuk
menghadapi musuh. Hal ini karena antibodi yang dihasilkan untuk suatu penyakit
belum tentu berhasil bagi penyakit lainnya.
Membuat
antibodi spesifik untuk masing-masing musuh merupakan proses yang luar biasa
dan proses ini dapat terwujud hanya jika sel-sel B mengenal struktur musuhnya
dengan baik. Dan, di alam ini terdapat jutaan musuh (antigen). Satu sel B yang
sedemikian kecil, menyimpan jutaan bit informasi dalam memorinya, dan dengan
sadar menggunakannya dalam kombinasi yang tepat. Tersimpannya jutaan formula
dalam suatu sel yang sangat kecil merupakan keajaiban yang diberikan kepada
manusia. Yang tak kurang menakjubkan adalah bahwa kenyataannya sel-sel
menggunakan informasi ini untuk melindungi kesehatan manusia. Satu sel B
menggandakan antibodi spesifiknya dan mencantolkannya ke permukaan luar membran
selnya. Antibodi memanjang keluar seperti jarum, aerial yang sudah menyesuaikan
diri menunggu berkontak dengan sekeping protein tertentu yang bisa mereka
kenali. Antibodi tersebut terdiri dari dua rantai ringan dan dua rantai berat
asam amino yang bersambungan dalam bentuk Y. Setelah digandakan sampai jutaan,
sebagian besar sel B berhenti membelah dan menjadi sel plasma, jenis sel yang
bagian dalamnya berisi alat untuk membuat satu produk antibodi. Sebagian sel B
lain membelah terus tak berhingga, dan menjadi sel memori. Antibodi bebas yang
dibuat oleh sel plasma berkeliling di darah dan cairan limpa. Ketika antibodi
mengikatkan diri pada antigen sasarannya, bentuknya berubah. Perubahan bentuk
inilah yang membuat antibodi "menempel" di bagian luar makrofag.
4. ikatan antigen dan antibodi
Reaksi antigen dan antibodi
Kespesifikan
reaksi antara antigen dan antibodi telah ditunjukkan melalui
penelitian-penelitian yang dilakukan oleh Landsteiner. Ia menggabungkan
radikal-radikal organik kepada protein dan menghasilkan antibodi terhadap
antigen-antigen tersebut. Keputusan yang diperolehi menunjukkan antibodi dapat
membedakan antara kelompok berbeda pada protein ataupun kumpulan kimia yang
sama tetapi berbeda kedudukan.
Ikatan kimia antara antigen dan antibodi
Terdiri
dari ikatan non kovalen, (seperti ikatan hidrogen, van der Waals,
elektrostatik, hidrofobik), sehingga reaksi ini dapat kembali ke semula
(reversible). Kekuatan ikatan ini bergantung kepada jarak antara paratop dan
bagian-bagian tertentu pada epitop.
Reaksi pelarutan (precipitation)
Antara
antibodi khusus dengan antigen larut seperti protein. Penelitian yang dilakukan
oleh Heidelberger dan Kendall menunjukkan reaksi ini dapat optimum pada zona
kesetaraan (equivalence zone) di mana antibodi dan antigen terbentuk pada
kondisi yang paling sesuai untuk membentuk satuan ikatan (lattice). Pada zona
antibodi berlebih (antibody excess zone) dan zona antigen Berlioz (antigen
excess zone) maka pembentukan satuan ikatan tidak optimum dan masih terdapat
antibodi atau antigen bebas yang tidak terdapat dalam larutan.
Reaksi pembekuan (aglutinasi)
Antara
antibodi khusus dengan antigen partikulat seperti bakteria, sel dll.
Prinsip-prinsip reaksi pembekuan adalah sama seperti reaksi pelarutan. Di dalam
percobaan di atas antibodi spesifik terhadap antigen dicairkan dalam satu set
telaga piring mikrotiter (baris atas), kemudian antigen pada kepekatan yang
sama ditambah kepada setiap telaga yang mengandung antibodi. Selepas eraman
untuk jangka masa yang sesuai telaga-telaga dicerap untuk melihat sama ada
terdapat pembentukan aglutinat (baris kedua). Keputusan yang diperolehi
menunjukkan terdapat aglutinat terbentuk dalam telaga 2 – 5 dan tidak dalam
telaga-telaga lain. Dalam telaga pertama aglutinat tidak terbentuk walaupun
terdapat banyak antibodi kerana nisbah antigen:antibodi tidak optimum untuk
pembentukan aglutinat. Kepekatan antibodi adalah terlalu tinggi berbanding
antigen. Ini dipanggil sebagai fenomenon prozon. Dalam telaga 6 dan 7 kepekatan
antibodi adalah terlalu rendah dan tidak cukup untuk untuk menghasilkan
aglutinat. Dalam percubaan di atas titer antibodi terdapat pada telaga 5 kerana
ini ialah cairan tertinggi yang menghasilkan tindak balas positif, iaitu
penglutinatan. Rajah sebelah bawah menunjukkan mekanisme tindak balas
penghemaglutinatan tak terus (indirect hemagglutination reaction). Dalam kaedah
ini antigen larut diselaputkan ke permukaan eritrosit dan kehadiran antibodi
terhadap antigen tersebut dikesan.
Interaksi antigen-antibodi dapat menimbulkan berbagai akibat,
antara lain,
1.Presiptasi,
terjadi apabila antigen merupakan bahan larut dalam cairan garam fisiologik.
2.Aglutinasi,
terjadi apabila antigen merupakan bahan tidak larut ataupartikel-partikel kecil.
3.Netralisasi, terutama pada toksin.
4.Aktivasi komplemen.
5. Teknik Imunohistokimia
Teknik
imunohistokimia bermanfaat untuk identifikasi, lokalisasi, dan karakterisasi
suatu antigen tertentu, serta menentukan diagnosis, therapi, dan prognosis
kanker. Teknik ini diawali dengan pembuatan irisan jaringan (histologi) untuk
diamati dibawah mikroskop. Interaksi antara antigen-antibodi adalah reaksi yang
tidak kasap mata. Tempat pengikatan antara antibodi dengan protein spesifik
diidentifikasi dengan marker yang biasanya dilekatkan pada antibodi dan bisa
divisualisasi secara langsung atau dengan reaksi untuk mengidentifikasi marker.
Marker dapat berupa senyawa berwarna : Luminescence, zat berfluoresensi :
fluorescein, umbelliferon, tetrametil rodhamin, logam berat : colloidal,
microsphere, gold, silver, label radioaktif, dan enzim : Horse Radish Peroxidase
(HRP) dan alkaline phosphatase. Enzim (yang dipakai untuk melabel) selanjutnya
direaksikan dengan substrat kromogen (yaitu substrat yang menghasilkan produk
akhir berwarna dan tidak larut) yang dapat diamati dengan mikroskop bright
field (mikroskop bidang terang). Akan tetapi seiring berkembangnya ilmu
pengetahuan khususnya dunia biologi, teknik imunohistokimia dapat langsung
diamati (tanpa direaksikan lagi dengan kromogen yang menghasilkan warna)
dibawah mikroskop fluorescense.
Metode Direct
Prinsip
dari metode imunohistokimia direct adalah menggunakan antibodi primer yang
sudah terlabel dan berikatan langsung dengan antigen target secara langsung.
Metode langsung (direct method) merupakan metode pengecatan satu langkah karena
hanya melibatkan 1 jenis antibodi, yaitu antibodi yang terlabel, contohnya
antiserum terkonjugasi fluorescein isothiocyanate (FITC) atau rodhamin.
Pada
metode direct, antibodi spesifik yang mengenali antigen jaringan akan
dimodifikasi dengan mengkonjugasikan molekul indikator pada antibodi tersebut.
molekul indikator tersebut dapat berupa molekul yang berpendar seperti biotin
atau enzim peroksidase, sehingga apabila diberikan substrat akan memberikan
warna pada jaringan tersebut.
Metode Indirect
Prinsip
metode imunohistokimia indirect menggunakan antibodi primer yang tidak ada
labelnya, namun digunakan juga antibodi sekunder yang sudah memiliki label dan
akan bereaksi dengan IgG dari antibodi primer. Metode tidak langsung (indirect
method) menggunakan dua macam antibodi, yaitu antibodi primer (tidak berlabel)
dan antibodi sekunder (berlabel). Antibodi primer bertugas mengenali antigen
yang diidentifikasi pada jaringan (first layer), sedangkan antibodi sekunder
akan berikatan dengan antibodi primer (second layer). Antibodi kedua merupakan
anti-antibodi primer. Pelabelan antibodi sekunder diikuti dengan penambahan
substrat berupa kromogen. Kromogen merupakan suatu gugus fungsi senyawa kimiawi
yang dapat membentuk senyawa berwarna bila bereaksi dengan senyawa tertentu.
Penggunaan kromogen fluorescent
dye seperti FITC, rodhamin, dan Texas-red disebut metode immunofluorescence,
sedangkan penggunaan kromogen enzim seperti peroksidase, alkali
fosfatase, atau glukosa oksidase
disebut metode immunoenzyme. Pada metode ini antibodi spesifik yang mengenali
antigen jaringan disebut sebagai antibodi primer dan tidak dilakukan modifikasi
pada antibodi ini. Namun diperlukan antibodi lain yang dapat berikatan dengan
antibodi primer yang disebut dengan antibodi sekunder. Antibodi sekunder ini dimodifikasi
sehingga memiliki molekul indikator pada antibodi tersebut. Setiap 1 antibodi
primer dapat dikenali oleh lebih dari 1 antibodi sekunder, oleh karena itu,
setelah diberikan substrat akan terbentuk warna yang lebih jelas pada jaringan
tersebut.
Metode Peroxidase – anti – Peroxidase (PAP)
Adalah analisis imunohistokimia menggunakan tiga molekul
peroksidase dan dua antibodi yang membentuk seperti roti sandwich. Teknik ini
memanfaatkan afinitas antibodi terhadap antigen (enzim) untuk membentuk kompleks
imun stabil sebagai perlawanan terhadap proses kimia terkonjugasi Fitur unik
dari prosedur ini adalah larutan enzim – antibodi dan kompleks imun PAP. Enzim
Horseradish Peroksidase, protein imunogenik, digunakan untuk menyuntik spesies
tertentu dan merespon imun poliklonal yang dihasilkan terhadap enzim. Antiserum
ini dipanen dan ditempatkan dalam larutan pada enzim sehingga membentuk
kompleks imun yang larut.
Metode Avidin-Biotin-Complex (ABC)
Adalah metode analisis imunohistokimia menggunakan afinitas
terhadap molekul avidin- biotin oleh tiga enzim peroksidase. Situs pengikatan
beberapa biotin dalam molekul avidin tetravalen bertujuan untuk amplifikasi dan
merespon sinyal yang disampaikan oleh antigen target
